Verbesserung der Resistenz von Raps (Brassica napus) gegen die durch Sclerotinia sclerotiorum verursachte Weißstängeligkeit

Letzte Überarbeitung Nov/2010

Ziel des Projektes

Sclerotinia sclerotioum ist eine sehr bedeutsame pilzliche Krankheit im deutschen Rapsanbau. In Schleswig-Holstein und Mecklenburg-Vorpommern wurde über Infektionshäufigkeiten von 40% berichtet die durch eine Reduktion des Tausendkorngewichtes und dem vorzeitigen Aufplatzen von Schoten zu Ertragsverlusten von bis zu 50% führten (Pope et al., 1989).
Die in Deutschland registrierten Winter- und Sommerrapssorten verfügen über keine effiziente Resistenz gegen den Erreger der Weißstängeligkeit (Sclerotinia sclerotiorum). Das Ziel des Projektes, welches in Zusammenarbeit mit der GFP und Rapszüchtungsunternehmen durchgeführt wurde, ist daher brauchbare Screeningmethoden für eine systematische Suche von potentiellen Resistenzquellen in verschiedenen Genpools zu liefern. Wertvolles Material wird von den beteiligten Firmen zur Verfügung gestellt. Ein zweites Ziel des Projektes ist es verbesserte und verlässliche Bewertungsmethoden für die offizielle Sorteneinstufung zu liefern.

Feld-Screening von B. napus Genotypen

In 2007/2008 wurde ein Feldversuch durchgeführt bei dem Raps mit einer Mycelsuspension des Pathogens besprüht wurde. Trotzdem dieses Inokulationsverfahren nicht erfolgreich war, konnten aufgrund von Befallshäufigkeiten von 30%, die durch natürliche Infektionen zustande kamen, 24 Sorten vergleichend gestetet werden. Im darauf folgenden Anbaujahr (2008/2009) wurde ein Feldversuch mit 28 Sorten angelegt, die von den beteiligten Züchterhäusern zu Verfügung gestellt wurden. Der Versuch wurde an 3 Orten in Deutschland angelegt. Durch Ausbringen von Sklerotien an den jeweiligen Standorten wurde versucht den Befallsdruck zu erhöhen. Aufgrund ungünstiger Wetterbedingungen während der Blüte war diese Vorgehensweise jedoch nicht erfolgreich und soll daher in 2009/2010 wiederholt werden.

Wurzelinokulationsversuche

Ein Rapswurzelbefall mit S. sclerotiorum wurde an verschiedenen Standorten in Deutschland und Frankreich festgestellt, welcher eine neue Art des Befalls darstellt. Wir haben Isolate von infizierten Wurzeln gesammelt und Infektionsversuche im Gewächshaus durchgeführt. Hierbei kamen verschiedene Inokulationsverfahreb zum Einsatz bei denen uach der Einfluß verschiedener Temperaturen untersucht wurde. Mit Pilz überwachsene Agarstückchen wurden direkt an die Primärwurzel gebracht, welches sich als eine geeignete Methode darstellte einen Wurzelbefall im Gewächshaus nachzustellen. Aufgrund dieses Verfahrens werden wir nun untersuchen, ob sich Isolate, die auf befallene Wurzel zurückgehen von solchen unterscheiden, die aus befallenene Stängeln gewonnen wurden. Weiterhin sind wir daran interessiert verschiedenene Pflanzengenotypen auf eine Sproß- bzw. Wurzelinfektion dahingehend zu untersuchen, ob es eine organspezifische Resistenz bzw. Anfälligkeit gibt.

Resistenz-Screening im Labor und Gewächshaus

Ein Laborscreenig wird für einen erhöhten Genotypendurchsatz im Resistenzscreening benötigt. Der Labortest basiert auf einen Test der Empfindlichkeit pflanzlichen Gewebes gegen Oxalsäure, einem wichtigen Pathogenitätsgfaktor von S. sclerotiorum. Vorläufige Testdaten stimmemn gut mit den Screeningdaten im Feld des Versuchsjahres 2007/2008 überein. Weitere Anpassungen und Tests werden zurzeit durchgeführt, um die Verlässlichkeit und Effizienz dieses Labortests weiter zu verifizieren.
Der Gewächshaustest wird an blühenden Pflanzen durchgeführt (BBCH 63-65), die mit Mycel überwachsenen Agarstückchen The greenhouse screening is performed with flowering plants (growth stage 63 to 65) which are inoculated by placing an agar plug with minokuliert werden, indem diese in eine Blattachsel oder die Achsel eines Nebensprosses plaziert werden. Läsionslängen werden periodisch gemessen, die Rückschlüsse auf die Resistenz des getesteten Genotyps erlauben sollen. Auf diese Weise werden eine breite Palette von Pflanzen verschiedener Genpools getestet um Resistenzquellen zu identifizieren. Zusätzlich werden die Ergebnisse in Bezug zu Experimenten mit im Labor erzeugten Ascosporen gesetzt.

Transformation von B. napus

Um die zuvor genannten Beurteilungsverfahren zu verifizieren werden zudem B. napus Pflanzen mit transgener S. sclerotiorum- Resistenz getestet. Zwei Genkonstrukte wurden von Herrn Dr. Andreas Walz (University Hohenheim) zur Verfügung gestellt. Hierbei handelt es sich um Expressionskonstrukte unter der Kontrolle des 35S Promotors des Cauliflower Mosaic Virus. Beide Konstrukte tragen ein Kanamycin- Resistenzgen zur Selektion. Die verwendeten Gene kodieren für ein Oxalat-Oxidase aus Triticum aestivum und für eine Oxalat-Decarboxylase aus Trametes versicolor.

Die Effizienz beider Konstrukte wurde in Tomate und Tabbak gezeigt, in denen transformierte Pflanzen die Verbreitung des Pilzes reduzierten (Walz et al., 2008 a and b). Ähnliche Ergebnisse konnten für die Oxalat-Oxidase in transformierter Sojabohne hinsichtlich der Stängelfäule von Donaldson et al. (2001) gezeigt werden, während die Effizienz der Oxalat-Decarboxylase weiter in Salat von Dias et al. (2006) belegt wurde.

Zum Nachweis beider Gene wurden PCR Assays mit spezifischen Primern entwickelt. Die Transformation wurde mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens unter der Betreuung von Dr. Christian Möllers (Georg-August-Universität Goettingen Department of Crop Sciences, Division of Pant Breeding) durchgeführt. Nach der Transformation wurden genetisch modifizierte Pflanzen regeneriert. Bis jetzt wuchsen die Pflanzen auf MS medium, und sind mittlerweile größtenteils in Erde umgesetzt worden. Diese Pflanzen sollen als Resistenzstandards im Gewächshaus und Labor zu Überprüfung der Screening Assays eingesetzt werden. Zudem sollen diese Pflanzen dazu führen ein besseres Verständnis über die Rolle von Oxalsäure im Infektionsprozess zu erlangen.

Bearbeiter

Tobias Wulf (Doktorand), Kerstin Höch (Doktorandin)

Betreuer

Prof. Andreas von Tiedemann

Fördernde Institution

Literatur

Pope, S. J.; Varney, P. L., Sweet, J. B. (1989) Susceptibility of cultivars of oilseed rape to S. sclerotiorum and the effect of infection on yield. Production and protection of oilseed rape and other brassica crops. Aspects of Applied Biology 23, 451-456
Dias, B. B. A., Cunha, W. G., Morais, L. S., Vianna, G. R., Rech, E. L., de Capdeville, G. and Aragão, F. J. L. (2006) Expression of an oxalate decarboxylase gene from Flammulina sp. in transgenic lettuce (Lactuca sativa) plants and resistance to Sclerotinia sclerotiorum. Plant Pathology 55, 187-193.
Donaldson, P. A., Anderson, T., Lane, B. G., Davidson A. L. and Simmonds, D. H. (2001) Soybean plants expressing an active oligomeric oxalate oxidase from the wheat gf-2.8 (germin) gene are resistant to the oxalate-secreting pathogen Sclerotina sclerotiorum. Physiological and Molecular Plant Pathology 59(6), 297-307.
Dunker, S. & Tiedemann, A. v. (2004) Disease/yield loss analysis for Sclerotinia stem rot in winter oilseed rape. IOBC wprs Bulletin (2004) 'Integrated Control in Oilseed Crops', vol. 27 (10), 59-66.
Walz, A., Zingen-Sell, I., Loeffler, M. & Sauer, M. (2008a)Expression of an oxalate oxidase gene in tomato and severity of disease caused by Botrytis cinerea and Sclerotinia sclerotiorum. Plant Pathology 57(3): 453-458
Walz, A., Zingen-Sell, I., Theisen, S. & Kortekamp, A. (2008b) Reactive oxygen intermediates and oxalic acid in the pathogenesis of the necrotrophic fungus Sclerotinia sclerotiorum. European Journal of Plant Pathology 120 (4): 317-330

letzte Überarbeitung Nov/2010