Exzellenzcluster: Mikroskopie im Nanometerbereich und Molekularphysiologie des Gehirns (CNMPB)

Für die Erforschung von Nervensystemen ist die Beobachtung von Zellprozessen sehr hilfreich. Als Marker kann die Calciumkonzentration in der lebenden Nervenzelle genommen werden. Um die Calciumkonzentration sichtbar zu machen werden Calciumsensoren eingesetzt. Es handelt sich um Fluorophore, die in Abwesenheit von Calcium nicht fluoreszieren können. Für uns war es von Interesse Calciumsensoren zu synthetisieren, die über bioorthogonale Funktionalitäten mit anderen Molekülen verknüpft werden können. Beispielsweise mit Polyethylenglykolen (PEG) um das Ausschleusen aus der Zelle zu verhindern. Außerdem soll über die Verknüpfung von Calciumsensoren und Fluorophoren über PEG die quantitative Calciumkonzentrationsmessung ermöglicht werden. Dafür muss die Konzentrationsmessung der Sensormoleküle unabhängig von der Calciumkonzentration möglich sein.

Abb. 1: Struktur des grünen Calciumsensor verbunden mit PEG (links) und in Lösung mit und ohne Calcium bestrahlt mit Licht bei 405 nm (rechts).

Um ein genaueres Verständnis über die Verteilung und Lokalisation von spannungsabhängigen Natrium Kanälen im Axon Initial Segment zu erhalten stellen markierte Conotoxine eine interessante Möglichkeit dar. Bei Conotoxinen handelt es sich um kleine Peptide (10 bis 45 Aminosäuren) die eine Vielzahl von Disulfidbrücken ausbilden können und eine hohe Selektivität für Ionenkanäle und Membran-Rezeptoren besitzen. Das µ-Conotoxin SIIIA blockiert mit hoher Spezifität spannungsabhängige Natrium-Kanäle, indem es den Kanal von der extrazellularen Seite blockiert. Für die Synthese des µSIIIA wurde ein Syntheseschema entwickelt, welches die korrekte Ausbildung der Disulfidbrücken gewährleistet und die Einführung eines Fluorophors mittels bioorthogonaler Reaktionen ermöglicht. Die markierten Conotoxine können zur Untersuchung der spannungsabhängigen Natrium Kanäle mittels patch-clamp-Experimenten genutzt werden.

Abb. 2: Übersicht über das synthestische Vorgehen und Markierung eines Conotoxins (oben links). Sequenz des µ-Conotoxin SIIIA; hervorgehoben die Aminosäure mit einem Fluorophor (unten links). 3D-Struktur des µ-Conotoxin SIIIA (rechts).

Zusätzlich werden modifizierte µ-Conotoxine SIIIA mit einer photolabilen Schutzgruppe markiert um eine gezielte räumliche und zeitliche Abspaltung während eines patch-clamp-Experiments untersuchen zu können.

Abb. 3: Photolabile Schutzgruppen ermöglichen eine räumliche und zeitlich kontrollierte Aktivierung eines geschützten Biomoleküls (links). Sequenz des µ-Conotoxin SIIIA; hervorgehoben die Aminosäure mit eine photolabilen Schutzgruppe. (rechts).